食品中细菌总数的检验实验步骤及注意事项

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食品中细菌总数的检验实验步骤及注意事项

　　一、实验目的要求

　　1、了解细菌总数检验的意义。

　　2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法3、掌握国标法测定菌落总数的方法和技能4、熟练无菌操作技术。

　　二、原理

　　菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

　　菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

　　三、试剂和仪器

　　（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）

　　规格名称

　　1、500ml广口瓶2、500ml三角瓶3、250ml三角瓶4、18×180mm试管数量1个1个2个3支

　　用途:稀释样品

　　配制:生理盐水

　　配制:营养琼脂稀释样品倒营养平板

　　5、1ml移液管5支

　　6、直径为90mm平皿10套

　　7、250ml量筒1支

　　8、玻璃珠：直径约5mm

　　（二）应灭菌、消毒的器材

　　剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只，开瓶器

　　（三）应制备的培养基

　　培养基总量所用容器

　　1、0.85%NaCl生理盐水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶2、平板计数琼脂（PCA）培养基：2瓶100ml/瓶250ml三角瓶四、实验内容

　　（一）、基本操作过程：

　　样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。（二）、样品的稀释（样品的处理）

　　样品：袋装乳粉

　　外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀

　　1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结团），采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇均匀，即为1:10的稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。

　　2、用1ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。

　　3、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。

　　4、根据对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。

　　5、用1ml生理盐水作空白对照试验，做2个平皿。?注意：

　　①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。

　　②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。

　　③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。

　　④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。（三）、倒平板

　　稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基（放置于46℃水浴保温）倾注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。

　　注意：

　　①培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过度，以免溅起触及上盖。

　　②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过20min。

　　（四）、培养

　　待琼胶凝固后，翻转平皿，置36±1℃温箱内培养48h后取出，立即计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。

　　注意：

　　（1）琼脂凝固后，就立即将平板放入培养箱内进行培养，以免细菌蔓延生长。

　　（2）

　　如果把不能立即计数，要将平板放入0～4℃冰箱中，但不能超过24h。

　　不同产品菌落总数测定的培养时间：

　　肉、乳、蛋及制品：37℃培养48h水产品：30℃培养48h：清凉饮料、调味品、糕点、果脯、酒类等：37℃培养24h五、结果报告

　　1、平皿菌落数的选择

　　（1）选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿，大于300的可记为多不可计。

　　（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。

　　（3）当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。2、菌落总数的计算

　　（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。

　　（2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算：N=∑C/（n1+0.1n2）d…………（1)式中：N―样品中菌落数；∑C―平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；nl―第一个适宜稀释度平板数；n2―第二个适宜稀释度平板数；d―稀释因子（第一稀释度）。

　　（3）若所有稀释度的平板菌落数均>300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

　　（4）若所有稀释度平板菌落数均<30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。（5）若所有稀释度平板均无菌落生长，则应按<1乘以最低稀释倍数计算。

　　（6）若所有稀释度均不在30～300之间，有的>300，有的又<30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

　　3、报告方法

　　（1）菌落数在1～100时，按四舍五入报告两位有效数字。

　　（2）菌落数≥100时，第三位数字按四舍五入计算，取前面两位有效数字，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。

　　（3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

　　（4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

　　（5）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

　　四、实验内容

　　（一）、基本操作过程：

　　样品称量→→样品的稀释→→倾注平皿→→培养5天→→计数报告。（二）、样品的稀释（样品的处理）

　　样品：糖果

　　用灭菌镊子夹取包装纸,称取数块共25g，加入预温至45℃的灭菌水225mL，待溶化后检验。

　　1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，以无菌操作开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中。然后加入225mL的灭菌水，采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇30min，振摇均匀，即为1:10的稀释液。

　　2、用10ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液10ml，注入无菌试管内，另用带橡皮乳头的1ml灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。

　　3、用1ml灭菌吸管，吸取上述1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌水的试管内，换一支1ml灭菌吸管反复吹吸5次，制成1∶100稀释液。

　　4、另取1ml灭菌吸管，吸取上述1∶100稀释液1ml，注入含有9ml灭水的试管内，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。

　　5、根据对检样污染的情况估计，选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同

　　时，即以吸取该稀释度的1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。

　　6、用1ml无菌水作空白对照试验，做2个平皿。?注意：

　　①加入检样液时，吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液，并将吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。

　　②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内紧贴。

　　③每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。（三）、倒平板

　　稀释液移入平皿后，及时将凉至46℃的培养基（可放置于46℃水浴保温）倾注入平皿约15ml，并正反转动平皿使混合均匀。?注意：

　　①培养基不能触及平皿口边沿，加入培养基后可正反两个方向旋转，但不可用力过度，以免溅起触及上盖。

　　②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜过长。（四）、培养：

　　待琼脂凝固后，翻转平皿，置25～28℃温箱内培养5天，从第3天开始观察后取出，共观察培养5天。五、菌落计数及报告：

　　选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。

　　1）计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。

　　2）若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

　　3）若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

　　4）若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。

　　五、结果报告

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