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细菌分离鉴定
目的要求：
熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法。
实验内容：
一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定
(一)标本采集
1.脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。
2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。
3.咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。
4.血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。
5.脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。
6.尿道、阴-道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右;女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。
(二)分离鉴定程序
待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。常见的致病性球菌检查程序如下。
直接涂片、革兰染色、镜检(形态、排列、染色性)
脓、痰、咽拭子
分泌物、脑脊液 观察菌落性状、溶血性、色素
血琼脂平板→ 涂片、染色、镜检
↑ 挑取可疑菌落 生化反应
血液、穿刺液 →肉汤培养基 纯分离 致病性测定
↓ 药敏试验
如培养液混浊时可涂片、染色、镜检
(三)常见临床标本的检查方法
1．脓拭子
在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。
材料
(1) 标本：脓拭子
(2) 培养基：血琼脂平板
(3) 兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片
方法 脓汁 → 革兰染色 → 镜检
↓ ↑
血琼脂平板 →观察菌落形态及溶血情况
↓
致病力试验
(1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。
(2)将脓汁涂布于血琼脂平板上，再以灭菌接种环作划线分离。置培养37℃培养18h～24h。
(3)经培养后据菌落特点及涂片检查结果进行初步识别，根据需要再作进一步鉴定。若菌落较大、溶血透明、产生金黄色色素、涂片为革兰阳性球菌并成堆排列时可能系葡萄球菌，应确定其为何种葡萄球菌;必要时再作血浆凝固酶试验及甘露醇发酵试验，确定其致病力。
2.咽拭子
咽喉中存在的细菌较多，可以有厌氧及需氧性链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四联球菌、脑膜炎球菌、卡他球菌、喉杆菌、结核杆菌枯草杆菌、百日咳杆菌肺炎杆菌及绿脓杆菌等。此外也可有白色念珠菌奋森螺旋体等。本实验以咽拭子作为标本，重点检查病原性球菌。
材料
(1)标本:咽拭子。
(2)培养基:血琼脂平板。
方法
咽拭子
↓
血琼脂平板
↓
观察菌落形态及溶血性
↓
革兰染色，镜检
取标本涂布于血琼脂平板，再以灭菌接种环划线分离，置37℃培养18h～24h培养。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。
可根据下述特点进行鉴别：
(1)在菌落周围产生2mm～4mm宽、界线分明、完全透明的溶血环、涂片为革兰阳性球菌并呈链状排列，可能是乙型溶血性链球菌。
(2)菌落细孝半透明、有草绿色溶血环、涂片为革兰阳性球菌呈链状排列，可能为甲型溶血性链球菌。需要进一步与肺炎球菌区别时，可做胆汁溶菌试验及菊糖发酵反应。
菌落细小半透明、不溶血、涂片为革兰阳性链状排列的球菌时，为丙型链球菌。
(4)菌落扁平边缘隆起、中央稍凹、半透明、呈草绿色溶血、革兰染色为阳性双球菌、呈矛头状排列时为肺炎球菌，应以胆汁溶菌及菊糖发酵反应与甲型溶血性链球菌区分。
(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革兰染色为阴性双球菌，呈肾形排列时，可能为脑膜炎球菌，需要进一步作氧化酶试验及糖发酵试验(接种于含血清之葡、麦、蔗糖发酵管中)。
二、粪便标本中肠道杆菌的分离与鉴定
(一)标本收集
取患者的粪便或肛-门拭子。
(二)鉴定程序
肠道杆菌为一大群革兰阴性杆菌，从形态及染色性上无法鉴别为何种菌，只能依靠生化反应和血清学反应进行鉴定。
患者粪便(粘液、脓血)→肠道选择、鉴别培养基(如ss、中国蓝、伊红美兰)
↓
挑取可疑菌落(据大孝颜色、透明度而定)
↓
双糖铁及其他鉴别培养基
↓
据结果分析鉴定
↓
玻片凝集(做出特异性诊断)
葡萄糖乳糖动力H2S尿素
⊕⊕±--艾希菌属非致病菌
⊕+---克雷伯菌属
⊕±+++变形杆菌
⊕-++-乙型副伤寒致病菌
⊕-+±-甲型副伤寒
+-++-伤寒杆菌
+----痢疾杆菌
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